RICERCA SUL GRADING DEGLI EMBRIONI

postato da Giulia101981

Sommario
Scopo del lavoro è quello di fornire una classificazione aggiornata, approfondita e revisionata del grading embrionale. Partendo dalla classificazione degli ovociti proseguendo con l'osservazione della morfologia e della fertilizzazione degli zigoti, formuliamo uno score degli stessi, evidenziando quelli che poi verranno presi in considerazione per le caratteristiche morfologiche e qualitative embrionali, identificati da uno score che evidenzia la migliore qualità per i differenti parametri considerati.

Introduzione
Nella fertilizzazione in vitro (IVF), l'obiettivo è di prelevare diversi ovociti maturi per la fecondazione poiché esiste una diretta correlazione tra il numero di embrioni nell'utero e l'incidenza di gravidanza.
Il recupero delle cellule uovo e la loro identificazione viene fatta, in seguito al Pick-up; gli ovociti si lavano, e si trasferiscono immediatamente nel sistema di coltura, in incubatore a C02.
Dopo 17-20 ore dall'inseminazione le cellule sono osservate al microscopio invertito, per un accurato score della fertilizzazione.
Le uova fecondate hanno normalmente due pronuclei, due globuli polari, forma regolare,
con zona pellucida intatta ed un nitido e sano citoplasma.
Dopo il controllo della fertilizzazione gli ovociti con chiari segni di fecondazione sono
trasferiti in una nuova embriocoltura, e posti di nuovo in incubatore a C02 da 24 a 48 ore per
selezionare gli embrioni per il transfer. L'osservazione per lo sviluppo degli embrioni si attua ogni 24 ore. Al secondo giorno di divisione l'embrione può avere da 2 a 8 cellule, ed è possibile effettuare un grading.
La normale morfologia dello sviluppo dell'embrione ha suscitato negli ultimi tempi un notevole interesse da parte dei ricercatori operanti nei centri FIVET, in particolar modo si è cercato di correlare le caratteristiche e gli aspetti particolari delle cellule embrionali all'osservazione microscopica, con i tassi di gravidanza. Al contempo si è cercato di uniformare i criteri di valutazione degli embrioni al fine di creare un grading embrionale condivisibile.
Lo standard corrente dei criteri morfologici usati nella valutazione della qualità embrionale prima del transfer, include:
Numero e grandezza (volume) dei blastomeri
% di frammentazioni
Blastomeri Multinucleati ed citoplasma
Aspetto della zona pellucida
Simmetria delle cellule.

Discussione ed osservazione
Gli ovociti recuperati a seguito del pick up vengono osservati per determinarne la qualità, la maturità ed il tempo ottimale per l'inseminazione.
La maturità ovocitaria viene valutata in base ai seguenti parametri:
Volume
Densità
Maturità nucleare
Maturità citoplasmatica
Struttura e disposizione delle cellule della corona radiata, del cumulo ooforo e della granulosa.
Il criterio utilizzato per classificare gli ovociti è il seguente:
1. VESCICHETTE GERMINALI: l'ovocita è molto immaturo. Non c'è espansione delle cellule radiali che sono strettamente compatte intorno all'uovo. All'interno del citoplasma è evidente un grande nucleo (vescicola germinale), osservato mediante l'inverto-microscopio.
L'ovocita è allo stadio maturativo della profase della 1 divisione meiotica. Si lascia in incubazione per 24 ore per attendere la maturità nucleare; solo dopo lestrusione del 1 globulo polare si può procedere all'inseminazione. Nonostante tale modalità, la percentuale di fertilizzazione è molto bassa.
2. METAFASE I: l'ovocita è immaturo, è circondato dalle cellule della corona e da quelle del cumulo strettamente impacchettate le une sulle altre. Non presenta più la vescichetta germinale, ma non ha ancora estruso il 1globulo polare; ciò sta ad indicare che l'uovo si trova in metafase I. Deve essere pre-incubato per 12-24 ore prima dell'inseminazione.
3. METAFASE II:
a) Preovulatorio: è il livello ottimale di maturazione per un successo di fertilizzazione. Le cellule della corona sono fissate all'uovo ma in maniera radiale; il globulo polare è estruso, le cellule del cumulo ooforo sono espanse.
b) Molto maturo: l'uovo è chiaro come una pallida sfera, le cellule della corona radiale sono ridotte e dissociate dall'uovo. Il cumulo è abbondante e scuro. L'ultimo stadio di questa fase maturativa è una condensazione del cumulo in piccole gocce nere.
c) Luteinizzato: l'uovo è molto pallido ed è difficile da trovare, le cellule della granulosa e del cumulo, sono scure ed ammassate in modo non uniforme tra loro; le cellule della corona sono molto espanse. Si devono inseminare subito anche se hanno bassa probabilità di fertilizzazione.
d) Degenerato: le cellule della granulosa sono frammentate, hanno laspetto di un merletto. 
L'ovocita è molto scuro e può essere difficile da identificare. Gli ovociti fecondati sono osservati dopo 17- 20 ore. Una varietà di differenti caratteristiche possono essere osservate; il citoplasma di uova normalmente fertilizzate è debolmente granulare, mentre il citoplasma di uova non fertilizzate tende ad essere completamente trasparente ed informe. Il citoplasma può variare da trasparente, debolmente granulare a marrone, o nero o degenerato.
L'aspetto delluovo può anche variare da perfettamente sferico ad irregolare. Un alone trasparente alla periferia del citoplasma spesso 5-10 mm indica una buona attivazione e inizio della meiosi.
I dettagli della morfologia e della fertilizzazione dovrebbero essere registrati per ogni zigote come referenza per la scelta degli embrioni per il transfer in seconda giornata.
Gli zigoti, vengono osservati individualmente per dargli un punteggio, lo score da noi usato tiene conto di tre fattori:
La posizione dei pronuclei
La morfologia dei nucleoli
L'aspetto del citoplasma

1. posizione pronuclei score
a) opposti in centro 5
b) opposti non centrali 4
c) non opposti 3
d) grandezza diversa 2
e) split 1
2. morfologia nucleare score
a) allineati in numero pari 5
b) non allineati in ugual numero 4
c) non allineati in disuguale numero 3
d) piccoli 2
e) miscelati 1
3.aspetto del citoplasma score
a) area granulare definita 5
b) area granulare definita con vesciche 4
c) area granulare meno definita 3
d) assenza di area granulare 2
e) assenza di area granulare più vesciche 1
Gli ovociti che non mostrano segni di fecondazione, potrebbero avere ritardati uno o più degli eventi coinvolti nella fertilizzazione.
In questi ovociti con fertilizzazione ritardata nei quali i pronuclei appaiono in seconda giornata, gli embrioni che si formeranno tendono ad avere uno sviluppo potenziale dispari.
Questi sono messi in coltura separatamente ed usati nei caso di un basso numero di embrioni normalmente fertilizzati.
Le caratteristiche di una incompleta o ritardata fertilizzazione sono le seguenti:
Non fertilizzato: a) un singolo globulo polare e nessun nucleo nel citoplasma.
Fertilizzato: a) nessun pronucleo , due globuli polari: l'ovocita è attivato, ma la visione dei pronuclei è ritardata.
Singolo pronucleo 2 globuli polari: l'ovocita è attivato ma l'osservazione del pronucleo dello sperma è ritardata o soppressa.
Singolo pronucleo 1 globulo polare: il pronucleo contiene il genoma femminile mentre è assente il genoma maschile.
Tra gli ovociti con fertilizzazione anormale ci sono gli zigoti multinucleati; questi devono essere messi in coltura separatamente in modo da non essere selezionati per il trasferimento, poiché dopo la divisione cellulare non sono più distinguibili dagli ovociti a 2 PN.
Questi ovociti contengono una copia del genoma maschile e due copie del genoma femminile (triploidi).
A conferma dellimportanza di quanto sopra esposto, sulla necessità di formulare un score degli zigoti, riportiamo in tale tabella i nostri risultati comparativi, nei confronti di quegli zigoti per i quali non è stato formulato tale score.
GRAVIDANZE cl. e % di impianto in relazione al PN score (tabella)
Transfer 3 giorno
PN score No PN score
Grav. cl. / ET 57% a 32.8%
% impianto 31% a 19%
Transfer 5 giorno
Grav. cl. / ET 72.6% a 57.5%
% impianto 52.3% a 38.7%
a P < 0.01
L'embrione trasferito in 5 giornata non compromette la gravidanza, anzi si attua una maggiore selezione poiché si eliminano quelli che mostrano un precoce arresto della divisione in vitro.
Gli embrioni con divisione veloce hanno il più alto numero di cellule al momento del transfer, si pensa abbiano maggior probabilità d impianto.
La maggior parte degli embrioni presentano frammentazioni, e non è chiaro se queste frammentazioni sono effetto delle condizioni di coltura, della stimolazione follicolare o è una caratteristica dello sviluppo umano.
In 15 anni di embriologia clinica non ci sono lavori sulle cause delle frammentazione. Il grado di frammentazione varia da 5-10% al 100% è possono essere sia localizzate che sparse. Dal 3 giorno sono osservati 5 distinti campioni di frammentazioni:
1. <5% del volume dello spazio perivitellino è occupato dai frammenti.
2. Tutti o la maggior parte dei frammenti localizzati perifericalmente allo spazio perivitellino (con 5 o più cellule normali visibili)
3. Piccoli frammenti sparsi tra le cellule o in tutto lo spazio perivitellino di dimensioni simili.
4. Grandi frammenti indistinguibili dai blastomeri e sparsi dappertutto nello spazio perivitellino (PVS) di solito associato con poche cellule di differente misura.
5. Frammenti sparsi dappertutto nello spazio PVS, appaiono degenerati.
Il potenziale di impianto è maggiore nei tipi 1 e 2 e diminuisce nei tipi 3 e 4.
FRAMMENTAZIONE % di gravidanza e di impianto in relazione alla presenza ed al tipo di frammenti 
Gli embrioni vengono osservati all'inverto- microscopio per selezionare i migliori per transfer. Comunemente vengono classificati attribuendo il grado più alto al gruppo di embrioni trasferiti che hanno dato luogo al concepimento, secondo questi criteri:
GRADO 1 :Gli embrioni hanno sempre blastomeri regolari, circolari di uguale grandezza, simmetrici, con zona pellucida intatta, ed hanno pochissime frammentazioni meno del 10%. Tutti blastomeri hanno un nucleo.
GRADO 2 :Copre una grossa parte di stadi morfologici. Hanno blastomeri di grandezza simile,ma con una differenza non superiore al 20% tra luno e l'altro. Divisione asimmetrica con blastomeri di ugual misura , frammentazioni<10% ; <25% blastomeri multinucleati.
GRADO 3ivisione simmetrica, diversa misura dei blastomeri, frammentazione non superiore al 50%; i restanti blastomeri devono essere almeno in condizioni ragionevoli come quelli del grado 2. La zona pellucida è intatta < 50 % blastomeri multinucleati.
GRADO 4: Divisione asimmetrica, blastomeri di diversa misura, frammentazione> 50% >75% blastomeri multinucleati.
GRADO 5:Nessuna divisione, > 50% di frammentazione, tutti i blastomeri multinucleati.
Nel nostro centro usiamo un sistema di score; per determinare i parametri che influiscono sullo sviluppo potenziale degli embrioni; che sono:
Volume dei blastomeri
Multinucleazione
Livelli di frammentazione
1) Volume dei blastomeri score
a) divisione simultanea simmetrica, egual misura 5
b) divisione simultanea, egual misura 4
c) divisione simultanea, diverse misure 3
d) divisione non simultanea, diverse misure 2
e) non diviso 1
2) Multinucleazione score
a) un nucleo in ogni blastomero 5
b) < 25% blastomeri multinucleati 4
c) < 50% blastomeri multinucleati 3
d) <75% blastomeri multinucleati 2
e) tutti i blastomeri multinucleati 1
I
3) Livelli di frammentazione score
a) nessun frammento 5
b) < 10% frammentazioni 4
c) < 25% frammentazioni 3
d) <40% frammentazioni 2
e) > 40% frammentazioni 1
Per descrivere la morfologia degli embrioni usiamo una formula riassuntiva aggiornata seguendo la letteratura mondiale. Sembra difficile ma in realtà una volta assimilata è molto veloce ed immediata. Offre il grande vantaggio di descrivere con una semplice formula tutte le caratteristiche embrionali. Si divide in due parti: descrizione morfologica dell'embrione, e analisi qualitativa.
Analisi morfologica:
N (X,Y)Z
N: rappresenta il numero di blastomeri
X: rappresenta la dimensione dei blastomeri
1. blastomeri di ugual dimensione
2. se i blastomeri sono asimmetrici
Y: rappresenta la percentuale di frammentazioni enucleate
1: 0-10%
2: 10-30%
3: 30-50%
4: >50%
Z: rappresenta la qualità del citoplasma
A. buona qualità del citoplasma
B. scarsa qualità citoplasmatica (granulosa e/o vacuoli)
Nn: numero di cellule che presentano un singolo nucleo visibile
MN: indica la presenza di almeno un blastomero multinucleato
X: numero di nuclei presenti nel blastomero
Y: 0 se i nuclei presenti sono di ugual dimensione
1 se i nuclei presenti sono di diversa dimensione
Classificazione qualitativa degli embrioni
1. velocità di crescita Day 2 (44-48h) Day 3 (66-70 h)
Score 0 4 cellule 6 cellule
+2 2-3 cellule 4-5 cellule
+3 < 2 cellule < 4 cellule
2. dimensione blastomeri
Score 0 uguali
+1 Moderatamente disuguali
disuguali
3. frammentazioni
Score 0 0-10%
+1 10-30%
+2 30-50%
+3 >50%
4. qualità citoplasmatica
Score 0 Citoplasma A
+1 Citoplasma lievemente B
Citoplasma B
5. status nucleare
Score 0 Nessun blastomero multinucleato
+1 Blastomeri multinucleati
La somma ditali score ci permette di classificare gli embrioni:
Embrione tipo A ottima qualità score 0-1
Embrione tipo B buona qualità score 2-3
Embrione tipo C scarsa qualità score 4-5
Embrione tipo D pessima qualità score >5
Gravidanze cl e % dimpianto in relazione allo score embrionale:
Emb. Tipo A Emb. Tipo B Emb. Tipo C Emb. Tipo D
Gravidanze ciclo 61% 36% 17% 5% 3%
% dimpianto 32% 18% 10% 3% 1%

Conclusione
La classificazione usata, permette di determinare un esatto grading dell'embrione, perché tiene conto di tutti gli aspetti morfologici e qualitativi, e di predirne la potenzialità di sviluppo in vitro e quindi in vivo di quel determinato embrione.

UNA COPIA DELLO STUDIO LA TROVATE QUI:
infertilita.forumfree.it/?act=Attach&type=post&id=425038748
Dr. A. Di Filippo – Dr.ssa C. Concas CARAN srl - Caserta

LA DISCUSSIONE SUL FORUM INVECE QUI:
http://forum.alfemminile.com/forum/f110/__f104306_f110-Ricerca-molto-interessante-per-chi-vuole-farsi-una-cultura-su-ovociti-ed-embriorni.html